細胞組織張力和細胞滲透壓以促進小腸隱窩形成

2021-12-08 18:23:00

類器官作為近十年來新興的三維組織培養(yǎng)模型，其優(yōu)勢在于可以在體外一定程度上復(fù)制體內(nèi)組織的細胞組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)乃至生理學(xué)功能。作為體外培養(yǎng)系統(tǒng)，類器官比起哺乳動物模型更易于在單細胞及分子層面上進行基于成像的大規(guī)模表型分析。該課題正是利用小腸類器官的優(yōu)勢，克服了小腸作為內(nèi)臟難以進行大規(guī)模細胞實時活體成像的困難，結(jié)合物理學(xué)模型分析，對富集小腸成體干細胞的隱窩組織（crypt）的形態(tài)發(fā)育進行了突破性的研究。

在類器官里小腸隱窩的發(fā)育始于潘氏細胞（Paneth Cell）的出現(xiàn)。潘氏細胞分泌Wnt 等干細胞誘導(dǎo)因子，促進干細胞的生成。干細胞和潘氏細胞聚集形成隱窩組織，隆起并逐漸發(fā)育為成熟的芽狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)對于隱窩維持小腸干細胞庫至關(guān)重要，但此形態(tài)發(fā)生的發(fā)育過程和機制由于小腸活體研究的難操作性長期缺乏足夠的研究。

Liberali組首先通過對細胞連接蛋白的免疫熒光染色和成像，分割出小腸絨毛組織(villus) 和隱窩組織（crypt）內(nèi)所有細胞的頂膜（apical membrane，上皮細胞對應(yīng)腔體的細胞膜）及基底膜（basal membrane，上皮細胞對應(yīng)細胞外基質(zhì)的細胞膜，通常位于頂膜的對立面）的形狀。近萬單細胞頂膜和基底膜的統(tǒng)計結(jié)果確定了絨毛組織基底膜和隱窩組織頂膜顯著收縮的表型。通過激光片層掃描顯微鏡長時間追蹤記錄帶有熒光蛋白標(biāo)記的類器官發(fā)育過程和利用機器學(xué)習(xí)分割組織的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隱窩形成伴隨類器官腔內(nèi)空間的劇烈減小。

細胞膜收縮和腔體體積減小均屬于組織形態(tài)變化的一部分，而形態(tài)的變化受機械力的調(diào)控。為了充分理解這兩種表型背后的力學(xué)原理，以及它們與隱窩芽狀結(jié)構(gòu)形成的相關(guān)性，Hannezo組設(shè)計了涵蓋細胞頂-基極性、單細胞結(jié)構(gòu)、絨毛-隱窩組織區(qū)域劃分、組織厚度和類器官腔體大小的三維頂點模型（3D vertex model）。通過模型演算和實驗測量對比，最終確定絨毛和隱窩組織在頂-基極性上相反的組織張力可以導(dǎo)致隱窩出芽。Liberali組通過在活細胞膜上的激光切割和顯微吸量實驗，檢測出課題最初測量到的絨毛組織基底膜和隱窩組織頂膜顯著收縮直接對應(yīng)其更強的組織張力，至此為力學(xué)機制提供了重要的實驗支持。絨毛組織基底膜和隱窩組織頂膜對應(yīng)的強組織張力分布由該課題命名為組織自發(fā)性彎曲, 對應(yīng)脂質(zhì)雙分子膜領(lǐng)域內(nèi)的自發(fā)性彎曲（spontaneous curvature）經(jīng)典力學(xué)模型。進一步模型演算推導(dǎo)出腔體體積減小可以極大促進隱窩出芽過程，而該機制也符合傳統(tǒng)自發(fā)性彎曲力學(xué)模型的原理。一系列調(diào)節(jié)類器官組織張力和腔體體積的實驗均驗證了模型理論的正確性。并且模型預(yù)測到一種從未檢測過的新表型也得到實驗結(jié)果的吻合，即隱窩出芽后腔體即使被誘導(dǎo)極端膨脹，也不會消除已經(jīng)形成的芽狀結(jié)構(gòu)。此表型解釋了生理學(xué)上，當(dāng)腹瀉的癥狀發(fā)生時，小腸隱窩可以保持芽狀結(jié)構(gòu)，進而維護干細胞群和腸道上皮的穩(wěn)態(tài)。

接下來Liberali組通過單細胞測序、蛋白表達成像、藥物處理等功能性研究結(jié)合類器官個體和單細胞水平的大規(guī)模圖像分析統(tǒng)計確定了組織自發(fā)性卷曲和腔體體積縮小的分子細胞學(xué)機制。其中組織自發(fā)性卷曲主要由非肌細胞肌動球蛋白產(chǎn)生的細胞膜上的機械力導(dǎo)致。而干細胞和潘氏細胞都具有產(chǎn)生頂膜張力的能力，且干細胞產(chǎn)生的頂膜張力更強。分化的絨毛組織的腸上皮細胞（enterocyte）則產(chǎn)生獨特的基地膜張力。有趣的是，細胞分化誘導(dǎo)實驗暗示腔體縮小也是由腸上皮細胞引起。模型推算同時得出類器官的總體積大致不變，腔體體積劇烈變小，如果腔體體積轉(zhuǎn)移到絨毛組織，力學(xué)上對隱窩出芽的幫助遠大于轉(zhuǎn)移到其他組織里。類器官單細胞體積和小鼠腸道上皮單細胞大小測量均支持腸上皮細胞的體積增加對應(yīng)腔體體積減小。最終通過篩選測試一系列和吸收功能有關(guān)的蛋白及蛋白功能實驗驗證了小腸上皮細胞細胞膜上的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白通過調(diào)節(jié)細胞滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）吸收腔內(nèi)液體進而縮小腔體體積。